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一、通用內(nèi)參抗體定義及應(yīng)用

內(nèi)參蛋白即內(nèi)部參照蛋白，對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來(lái)說(shuō)一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物。

所有WB實(shí)驗(yàn)都需要內(nèi)參，用以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個(gè)Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。

二、內(nèi)參抗體使用方法

1.標(biāo)記內(nèi)參使用法：只要在二抗孵育時(shí)加入HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可。

2.普通內(nèi)參：當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí)，可以先進(jìn)行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測(cè)。然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測(cè)。

3.當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量?jī)刹糠郑箖?nèi)參蛋白與目的蛋白分開(kāi)。然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行。

三、在種類繁多的內(nèi)參抗體中，如何選擇合適的內(nèi)參抗體至關(guān)重要

1.考慮目的蛋白分子量，一般需要與目的蛋白分子量相差5kD以上。

2.根據(jù)蛋白表達(dá)位置選擇不同的內(nèi)參，不同細(xì)胞器選擇的內(nèi)參也不同。參考如圖
 

3.考慮組織特異性。以下為各種小鼠組織中常見(jiàn)內(nèi)參的表達(dá)水平，供大家參考。
 

4.考慮試驗(yàn)處理?xiàng)l件對(duì)于內(nèi)參表達(dá)的影響。

由于GAPDH是糖酵解過(guò)程中的酶，所以關(guān)于糖代謝的研究（如糖尿病模型）不能選擇GAPDH作為內(nèi)參；而某些細(xì)胞中，缺氧也會(huì)影響GAPDH的表達(dá)，此時(shí)也不可以選擇GAPDH作為內(nèi)參；將腫瘤組織與正常組織相比時(shí)，最好也不要選擇GAPDH作為內(nèi)參，因?yàn)楹芏嗄[瘤組織中的GAPDH相對(duì)于正常組織是高表達(dá)的，并且有文獻(xiàn)報(bào)道GAPDH可以作為腫瘤標(biāo)志物。

1) 做細(xì)胞骨架相關(guān)的研究時(shí)不能選擇β-actin作為內(nèi)參；

2) 做細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)，TBP和Lamin B會(huì)發(fā)生變化，此時(shí)不可以選擇其作為內(nèi)參；

3) 在加入抗癌和抗真菌藥物時(shí)，Tubulin的表達(dá)易受影響，不適合作為內(nèi)；

4) PCNA不適合作為非增殖細(xì)胞的內(nèi)參等。

5.不同的組織特異性

actin 即肌動(dòng)蛋白，有6種異構(gòu)體，存在組織分布特異性。β-actin作為內(nèi)參是得到了公認(rèn)的，但是也有特殊情況，比如脂肪組織中 β-actin含量就很低，在肌肉組織中beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來(lái)就應(yīng)該選擇不同的內(nèi)參，不能一概而論。

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