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蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)操作指南
來源：菲恩生物 發(fā)布時間：2019-12-12 10:37 點(diǎn)擊量：
蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）即Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。具體操作流程如下：
一、蛋白樣本的制備
1.樣本的處理
（1）組織樣本處理：取待測組織樣本，用預(yù)冷的PBS洗去組織表面血液及內(nèi) 部雜物。稱重剪碎，加入適量RIPA裂解液混合物（ 1mL的RIPA裂 解液中加入10μL PMSF）進(jìn)行勻漿裂解。勻漿后冰上震蕩裂解60min。在35%-40％的功率下，超聲處理樣本1min（冰浴條件下進(jìn)行），超聲2s，間隔2s，確保細(xì)胞充分裂解，降低樣本粘度。4℃，12,000rpm離心5min，取上清待測定蛋白濃度。
（2）細(xì)胞樣本處理：收集待測細(xì)胞樣本，用預(yù)冷的PBS洗去培養(yǎng)基等成分。加入適量RIPA 裂解液混合物（1 mL 的 RIPA 裂解液中加入 10μL PMSF）進(jìn)行冰上 裂解 60min。在 35%-40％的功率下，超聲處理樣本 1min（冰浴條件下進(jìn)行），超聲2s，間隔 2s，確保細(xì)胞充分裂解，降低樣本粘度。4℃，12,000rpm 離心 5min，取上清待測定蛋白濃度。
2.測定濃度
BCA 法測定蛋白濃度（Cat# K001）
3.收樣及保存
用 PBS 調(diào)整蛋白濃度，按照蛋白樣本：5×SDS 上樣緩沖液=4：1 的比例加入 5×SDS 上樣緩沖液，沸水煮 10min。12,000rpm 離心 2min，收取上清即可進(jìn)行后續(xù)的 Western Blot 實(shí)驗(yàn)，或保存于 -20℃或-80℃。
注：待測樣本建議總蛋白上樣量為 50-100μg，盡量保持各待測樣本上樣體積接近 10μL。
二、電泳
1.根據(jù)靶蛋白的分子量的大小，配制不同濃度的分離膠。每個泳道加入待測樣本，并預(yù)留一個泳道加入 5μL 的預(yù)染蛋白 Marker，以驗(yàn)證目的分子量大小及轉(zhuǎn)膜程度。加入 1×電泳緩沖液，開始電泳。
2.90v 恒壓電泳，待溴酚藍(lán)指示劑移動至濃縮膠與分離膠交界處成線狀，改為恒壓 120v跑完全程，直至電泳結(jié)束。
三、轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)）
1.根據(jù)靶蛋白的分子量選擇不同孔徑的PVDF或NC 膜。膜先在甲醇中浸泡 5min 使其活化，然后將膜浸泡于1×轉(zhuǎn)膜緩沖液（含 20％甲醇）中。同時將濾紙和纖維墊也浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中待用。
2.按照黑色板（負(fù)極）-纖維墊-濾紙-凝膠-PVDF或NC膜-濾紙-纖維墊-白色板（正極）依次放好，排出氣泡，夾緊后放入濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)槽內(nèi)。根據(jù)靶蛋白分子量調(diào)整轉(zhuǎn)膜條件。請務(wù)必保證轉(zhuǎn)膜過程在低溫條件下進(jìn)行。
注：此為濕轉(zhuǎn)的參考步驟，如用其他轉(zhuǎn)膜方法，請依具體情況進(jìn)行調(diào)整。
3.轉(zhuǎn)膜完成后，小心取出NC膜，TBST洗滌1min。
四、免疫印跡
1.用含 5% 脫脂奶粉的 TBST 溶液（封閉液）浸泡PVDF或NC膜，室溫?fù)u床封閉 1.5h。
2.用含 5% 脫脂奶粉的 TBST 溶液按照說明書推薦的稀釋比稀釋相應(yīng)的抗體，使 NC 膜浸泡于一抗孵育液中，4℃搖床孵育過夜。
3.TBST 充分洗滌 NC 膜 3 次，15min/次。
4.用含 5%脫脂奶粉的 TBST 溶液按照說明書推薦的稀釋比稀釋相應(yīng)的二抗，室溫?fù)u床孵育 1h。
5.TBST 充分洗滌 NC 膜 3 次，15min/次。
五、顯色曝光
1.將ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（Cat# K026）中的 A 液與 B 液按 1:1 比例混勻。
2.NC 膜從 TBST 洗液中取出后用濾紙吸干水分，均勻滴加ECL 混合液于 NC 膜上，排出氣泡，即可曝光。
3.調(diào)節(jié)對比度，多次曝光獲取最佳圖片效果。
蛋白免疫印跡法自發(fā)明以來被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生物學(xué)研究中的蛋白質(zhì)定性和半定量分析，尤其在醫(yī)療方面的應(yīng)用有著巨大的影響和發(fā)展空間。
一、蛋白樣本的制備
1.樣本的處理
（1）組織樣本處理：取待測組織樣本，用預(yù)冷的PBS洗去組織表面血液及內(nèi) 部雜物。稱重剪碎，加入適量RIPA裂解液混合物（ 1mL的RIPA裂 解液中加入10μL PMSF）進(jìn)行勻漿裂解。勻漿后冰上震蕩裂解60min。在35%-40％的功率下，超聲處理樣本1min（冰浴條件下進(jìn)行），超聲2s，間隔2s，確保細(xì)胞充分裂解，降低樣本粘度。4℃，12,000rpm離心5min，取上清待測定蛋白濃度。
（2）細(xì)胞樣本處理：收集待測細(xì)胞樣本，用預(yù)冷的PBS洗去培養(yǎng)基等成分。加入適量RIPA 裂解液混合物（1 mL 的 RIPA 裂解液中加入 10μL PMSF）進(jìn)行冰上 裂解 60min。在 35%-40％的功率下，超聲處理樣本 1min（冰浴條件下進(jìn)行），超聲2s，間隔 2s，確保細(xì)胞充分裂解，降低樣本粘度。4℃，12,000rpm 離心 5min，取上清待測定蛋白濃度。
2.測定濃度
BCA 法測定蛋白濃度（Cat# K001）
3.收樣及保存
用 PBS 調(diào)整蛋白濃度，按照蛋白樣本：5×SDS 上樣緩沖液=4：1 的比例加入 5×SDS 上樣緩沖液，沸水煮 10min。12,000rpm 離心 2min，收取上清即可進(jìn)行后續(xù)的 Western Blot 實(shí)驗(yàn)，或保存于 -20℃或-80℃。
注：待測樣本建議總蛋白上樣量為 50-100μg，盡量保持各待測樣本上樣體積接近 10μL。
二、電泳
1.根據(jù)靶蛋白的分子量的大小，配制不同濃度的分離膠。每個泳道加入待測樣本，并預(yù)留一個泳道加入 5μL 的預(yù)染蛋白 Marker，以驗(yàn)證目的分子量大小及轉(zhuǎn)膜程度。加入 1×電泳緩沖液，開始電泳。
2.90v 恒壓電泳，待溴酚藍(lán)指示劑移動至濃縮膠與分離膠交界處成線狀，改為恒壓 120v跑完全程，直至電泳結(jié)束。
三、轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)）
1.根據(jù)靶蛋白的分子量選擇不同孔徑的PVDF或NC 膜。膜先在甲醇中浸泡 5min 使其活化，然后將膜浸泡于1×轉(zhuǎn)膜緩沖液（含 20％甲醇）中。同時將濾紙和纖維墊也浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中待用。
2.按照黑色板（負(fù)極）-纖維墊-濾紙-凝膠-PVDF或NC膜-濾紙-纖維墊-白色板（正極）依次放好，排出氣泡，夾緊后放入濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)槽內(nèi)。根據(jù)靶蛋白分子量調(diào)整轉(zhuǎn)膜條件。請務(wù)必保證轉(zhuǎn)膜過程在低溫條件下進(jìn)行。
注：此為濕轉(zhuǎn)的參考步驟，如用其他轉(zhuǎn)膜方法，請依具體情況進(jìn)行調(diào)整。
3.轉(zhuǎn)膜完成后，小心取出NC膜，TBST洗滌1min。
四、免疫印跡
1.用含 5% 脫脂奶粉的 TBST 溶液（封閉液）浸泡PVDF或NC膜，室溫?fù)u床封閉 1.5h。
2.用含 5% 脫脂奶粉的 TBST 溶液按照說明書推薦的稀釋比稀釋相應(yīng)的抗體，使 NC 膜浸泡于一抗孵育液中，4℃搖床孵育過夜。
3.TBST 充分洗滌 NC 膜 3 次，15min/次。
4.用含 5%脫脂奶粉的 TBST 溶液按照說明書推薦的稀釋比稀釋相應(yīng)的二抗，室溫?fù)u床孵育 1h。
5.TBST 充分洗滌 NC 膜 3 次，15min/次。
五、顯色曝光
1.將ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（Cat# K026）中的 A 液與 B 液按 1:1 比例混勻。
2.NC 膜從 TBST 洗液中取出后用濾紙吸干水分，均勻滴加ECL 混合液于 NC 膜上，排出氣泡，即可曝光。
3.調(diào)節(jié)對比度，多次曝光獲取最佳圖片效果。
蛋白免疫印跡法自發(fā)明以來被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生物學(xué)研究中的蛋白質(zhì)定性和半定量分析，尤其在醫(yī)療方面的應(yīng)用有著巨大的影響和發(fā)展空間。
