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elisa試劑盒實驗中常見的5大問題應該如何解決？
來源：菲恩生物 發(fā)布時間：2019-11-14 10:47 點擊量：
酶聯免疫吸附測定法（elisa）是最基礎的免疫學實驗之一，ELISA試劑盒操作看似簡單，實則不然。ELISA試劑盒操作是一個非常嚴謹、極考驗操作者技巧和經驗的實驗，檢測結果沒有讀值、高cv值、高背景等諸多問題也是兵家常事。為了更好的解決這些問題，我們列舉了Elisa試劑盒實驗中常見的一些問題及解決方案。希望對各位從事科研工作的小伙伴有所幫助。
1.顯色淺，靈敏度低
| 序 號 | 原因 | 解決方法 |
| 1 | 試劑盒運輸時間過長，受高溫天氣影響酶的活性降低 | 試劑運輸過程中放足夠的冰袋并盡可能縮短運輸時間 |
| 2 | 試劑盒（包括未使用完的板條及其他組分）保藏條件不正確。 | 試劑盒內所有組分都應當在4℃冷藏，未使用完的板條要密封保存。 |
| 3 | 試劑盒使用時間已超期限 | 過期試劑盒不可使用 |
| 4 | 溫育時間不夠 | 嚴格按照說明書操作 |
| 5 | 恒溫箱溫度達不到37℃ |
注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在37 ±0.5℃。盡量避免頻繁開關恒溫箱門。 |
| 6 | 加樣量不足;移液時抽吸排放過快，有氣泡、或吸頭內殘留液體過多。 |
經常校正移液器，注意吸頭要與移液器吻合 。移液不宜過快，排放要完全。 |
| 7 | 顯色劑加量不足 | 按照說明書要求加入適量顯色液 |
| 8 | 試劑、樣品使用前未平衡至室溫。 | 試劑、樣品從低溫保藏條件中拿出來。 |
| 9 | 試劑開啟時間過長，污染。 | 試劑開啟后應該在盡可能短的時間內用完。 |
2.出現假陽性，背景高甚至花板
| 序 號 | 原因 | 解決方法 |
| 1 | 加樣時污染 | 注意更換槍頭，盡可能避免污染。 |
| 2 | 加酶時污染。 | 對先加樣后加酶的操作，加酶時要注意吸頭不要接觸標本，造成污染。當可能造成污染時，一定要更換吸頭，切忌僥幸心里。 |
| 3 | 恒溫箱溫度過高。 | 注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在37士0.5℃。 |
| 4 |
整個操作時間過長、造成反應時間不同（第一孔 與最后一孔反映應時間相差很懸殊）。氣溫高時 更明顯。 |
在盡可能短的時間內完成操作;盡量不要堆積塊板子操作（尤其手工操作時）。 |
| 5 | 洗液稀釋倍數過高。 | 按照要求倍數稀釋洗液。 |
| 6 | 洗板時浸泡時間不夠。 | 按要求操作，并適當延長浸泡時間。 |
| 7 | 洗板次數不夠。 | 按要求操作，不可任意減少洗板次數。 |
| 8 | 手工洗板方式不對。 | 洗板時垂直加入洗液，并保證一定的沖擊力;洗板要注滿板孔，并保證30-60秒的浸泡時間。 |
| 9 | 酶、顯色液污染。 | 使用容器要注意容器的清潔，避免污染。 |
| 10 | 顯色完后沒有終止反應。 | 顯色完立即終止反應。 |
3.重復性不好
| 序號 | 原因 | 解決方法 |
| 1 | 加樣量多少不一，操作時間長短不一。 |
重復同一樣品時，加樣量與加樣時間相同; 同時注意移液器的校準。加樣后應該將酶標 板放置在微量振蕩器上，充分混合;標本保 證一致、無污染;盡可能由同一名操作人員 操作，盡可能模擬相同的反應條件。 |
| 2 | 加入標本后沒有混勻。 | |
| 3 | 重復實驗的操作人員不同，操作習慣不同。 | |
| 4 | 反應時間、溫度等不同。 | |
| 5 | 標本不同（被混添或者處理不同）。 |
4.白板
| 序號 | 原因 | 解決方法 |
| 1 | 忘記加酶。 | 嚴格按照說明書操作。 |
| 2 | 忘記加顯色液。 | 嚴格按照說明書操作。 |
| 3 | 酶或顯色液污染失效。 | 防止組分被污染，注意保存。 |
| 4 | 把終止液當顯色液。 | 可以在加樣槽上貼標簽避免錯加。 |
5.標曲有值 樣本無值
| 序 號 | 原因 | 解決方法 |
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樣本孔沒有讀值或讀值極低 | ①分析標準曲線的讀值、標準曲線R值、背景值高低等，例如，即使標準曲線最高值只有1.2，但R值為0.999，這樣的標準曲線同樣可用。 |
| ②如果標準曲線正常，則可以排除ELISA試劑盒的品質問題，此時需要考慮樣本中目標蛋白的表達含量，從實驗經驗來看，樣本中目標蛋白表達量低是沒有讀值最常見的原因。 |
為減少在試驗中可能碰到的問題，應嚴格按照試劑盒內說明書操作，使用前應檢查盒內試劑是否超過有效期，并確定所有試劑齊全。
菲恩生物使用全機器生產，排除人工的不穩(wěn)定性，依靠電子移液槍和自動包板機精確加樣，嚴格控制批內差批間差。
