服務(wù)熱線(xiàn)
15623758226
免疫組化實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)背景著色的8大原因
來(lái)源：菲恩生物 發(fā)布時(shí)間：2019-09-18 11:37 點(diǎn)擊量：
免疫組化是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理-抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究。
然而理想是豐滿(mǎn)的，實(shí)際操作起來(lái)卻是骨感的，作為一種分析方法，常常會(huì)存在非特異著色的背景問(wèn)題。下圖中靶點(diǎn)均為胞膜定位，左邊背景著色嚴(yán)重，右邊染色效果優(yōu)良。
菲恩生物自主開(kāi)發(fā)幾千種抗體，積累了豐富的抗體檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)上萬(wàn)次切片檢測(cè)，從中摸索和總結(jié)出造成非特異著色的幾大主要因素。
1.抗體質(zhì)量問(wèn)題
抗體本身在靶點(diǎn)設(shè)計(jì)上如果特異性不夠，會(huì)導(dǎo)致非特異著色。一般來(lái)說(shuō)，單抗在特異性上相比多抗是具有優(yōu)勢(shì)的，但多抗由于識(shí)別任一抗原上的多個(gè)表位，多抗可放大低表達(dá)水平靶蛋白的信號(hào)，對(duì)微小抗原變化（例如多態(tài)性、糖基化異質(zhì)性或者輕微變性）的包容性更強(qiáng)，可用于非免疫原物種的靶蛋白的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要選擇合適的抗體。另外，抗體保存也應(yīng)注意防腐及防止反復(fù)凍融。
2.內(nèi)源性酶和生物素
當(dāng)選用肝、腎，脾組織作為樣本時(shí)，由于這些組織本身含有較高含量的過(guò)氧化酶和生物素，對(duì)于使用Hrp或生物素-親和素顯色系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)都會(huì)造成非特異性染色。對(duì)于內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，可以用0.9%的雙氧水來(lái)滅活。對(duì)于內(nèi)源性生物素，染色前將切片浸于25 μg/mL親和素溶液中15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分鐘。
3.抗體濃度過(guò)高
為了獲得良好的染色結(jié)果，一般應(yīng)優(yōu)化一抗的使用濃度，可參考供應(yīng)商提供的說(shuō)明書(shū)，但預(yù)實(shí)驗(yàn)也是必不可少的，摸索出最理想的工作濃度。
4.DAB染色時(shí)間太長(zhǎng)/變質(zhì)
DAB的作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，同樣會(huì)造成背景。DAB的顯色時(shí)間不是一成不變的，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)及時(shí)鏡檢，出現(xiàn)淺棕色時(shí)，馬上沖洗。出現(xiàn)棕色的時(shí)間過(guò)短，表明抗體濃度過(guò)高；出現(xiàn)棕色的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，表明抗體有效濃度過(guò)低。DAB要保存于避光干燥的地方，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前才加入H2O2。
5.組織變干
另外，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)保持樣本表面和外圍濕潤(rùn)，避免因試劑流失導(dǎo)致背景的產(chǎn)生。顯色時(shí)，一次不要同時(shí)染過(guò)多張片子，可分批顯色。
6.浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)
切片應(yīng)避免在緩沖液或修復(fù)液里面浸泡過(guò)夜，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)是連貫的，減少非必要程序和未知因素干擾。
7.清洗不充分
抗體孵育后的清洗應(yīng)充分，PBS使用前應(yīng)確定pH值，必要時(shí)可添加Tween-20增加洗滌強(qiáng)度。
8.封閉問(wèn)題
免疫組化一般使用血清稀釋液進(jìn)行封閉，為排除二抗本身造成的非特異吸附，可使用二抗動(dòng)物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要選擇非免疫羊血清。用PBS稀釋為3-10%的溶液孵育切片，37°C 10-30分鐘，封閉后不用清洗，直接甩掉即可。另外組織固定后可能會(huì)殘留部分游離醛基，在孵育抗體過(guò)程中也可能產(chǎn)生非特異結(jié)合，此時(shí)可使用0.3M 甘氨酸進(jìn)行封閉。
以上就是免疫組化實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的背景著色的原因，希望對(duì)大家的實(shí)驗(yàn)結(jié)果改進(jìn)有幫助。
然而理想是豐滿(mǎn)的，實(shí)際操作起來(lái)卻是骨感的，作為一種分析方法，常常會(huì)存在非特異著色的背景問(wèn)題。下圖中靶點(diǎn)均為胞膜定位，左邊背景著色嚴(yán)重，右邊染色效果優(yōu)良。
1.抗體質(zhì)量問(wèn)題
抗體本身在靶點(diǎn)設(shè)計(jì)上如果特異性不夠，會(huì)導(dǎo)致非特異著色。一般來(lái)說(shuō)，單抗在特異性上相比多抗是具有優(yōu)勢(shì)的，但多抗由于識(shí)別任一抗原上的多個(gè)表位，多抗可放大低表達(dá)水平靶蛋白的信號(hào)，對(duì)微小抗原變化（例如多態(tài)性、糖基化異質(zhì)性或者輕微變性）的包容性更強(qiáng)，可用于非免疫原物種的靶蛋白的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要選擇合適的抗體。另外，抗體保存也應(yīng)注意防腐及防止反復(fù)凍融。
2.內(nèi)源性酶和生物素
當(dāng)選用肝、腎，脾組織作為樣本時(shí)，由于這些組織本身含有較高含量的過(guò)氧化酶和生物素，對(duì)于使用Hrp或生物素-親和素顯色系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)都會(huì)造成非特異性染色。對(duì)于內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，可以用0.9%的雙氧水來(lái)滅活。對(duì)于內(nèi)源性生物素，染色前將切片浸于25 μg/mL親和素溶液中15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分鐘。
3.抗體濃度過(guò)高
為了獲得良好的染色結(jié)果，一般應(yīng)優(yōu)化一抗的使用濃度，可參考供應(yīng)商提供的說(shuō)明書(shū)，但預(yù)實(shí)驗(yàn)也是必不可少的，摸索出最理想的工作濃度。
4.DAB染色時(shí)間太長(zhǎng)/變質(zhì)
DAB的作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，同樣會(huì)造成背景。DAB的顯色時(shí)間不是一成不變的，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)及時(shí)鏡檢，出現(xiàn)淺棕色時(shí)，馬上沖洗。出現(xiàn)棕色的時(shí)間過(guò)短，表明抗體濃度過(guò)高；出現(xiàn)棕色的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，表明抗體有效濃度過(guò)低。DAB要保存于避光干燥的地方，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前才加入H2O2。
5.組織變干
另外，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)保持樣本表面和外圍濕潤(rùn)，避免因試劑流失導(dǎo)致背景的產(chǎn)生。顯色時(shí)，一次不要同時(shí)染過(guò)多張片子，可分批顯色。
6.浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)
切片應(yīng)避免在緩沖液或修復(fù)液里面浸泡過(guò)夜，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)是連貫的，減少非必要程序和未知因素干擾。
7.清洗不充分
抗體孵育后的清洗應(yīng)充分，PBS使用前應(yīng)確定pH值，必要時(shí)可添加Tween-20增加洗滌強(qiáng)度。
8.封閉問(wèn)題
免疫組化一般使用血清稀釋液進(jìn)行封閉，為排除二抗本身造成的非特異吸附，可使用二抗動(dòng)物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要選擇非免疫羊血清。用PBS稀釋為3-10%的溶液孵育切片，37°C 10-30分鐘，封閉后不用清洗，直接甩掉即可。另外組織固定后可能會(huì)殘留部分游離醛基，在孵育抗體過(guò)程中也可能產(chǎn)生非特異結(jié)合，此時(shí)可使用0.3M 甘氨酸進(jìn)行封閉。
以上就是免疫組化實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的背景著色的原因，希望對(duì)大家的實(shí)驗(yàn)結(jié)果改進(jìn)有幫助。
