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免疫沉淀（IP）實(shí)驗(yàn)7大常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案
來(lái)源：菲恩生物 發(fā)布時(shí)間：2023-08-04 14:56 點(diǎn)擊量：
免疫沉淀（IP）是一種可以純化和富集目標(biāo)蛋白的沉淀技術(shù)，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中可用于識(shí)別蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。免疫沉淀是一種重要的技術(shù)，用于研究蛋白質(zhì)之間的存在、相對(duì)豐度、大小、上調(diào)或下調(diào)、穩(wěn)定性、翻譯后修飾（PTMs）以及相互作用。以下為免疫沉淀實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案，希望對(duì)大家的實(shí)驗(yàn)有幫助。
1.變性洗脫法：如果后續(xù)進(jìn)行WB分析，可用此法十分高效，但洗脫下來(lái)的蛋白沒(méi)有生物活性。
六、陽(yáng)性和陰性對(duì)照如何設(shè)置
陽(yáng)性對(duì)照：就是常說(shuō)的input,可直接用細(xì)胞裂解液或提取好的蛋白進(jìn)行WB,確定樣本中目的蛋白的存在。
一、背景高
1.樣本中有不溶蛋白殘留，離心后應(yīng)立即取出上清。
2.洗滌不充分，優(yōu)化洗滌緩沖液，通過(guò)向洗滌緩沖液中加入去垢劑（0.5-1%NP-40/Triton X-100/Tween-20）、增加鹽離子濃度（如250mM NaCl/1-2mM DTT/β-ME），增加洗滌時(shí)間和次數(shù)來(lái)提高洗雜效率。
3.有非特異蛋白和磁珠結(jié)合，磁珠用BSA預(yù)封閉不充分，確保BSA新鮮，將磁珠和1%BSA 孵育1小時(shí)，使用前PBS洗滌3-4次。
4.抗體特異性不好，使用親和純化，特異性好的抗體。
5.抗體用量太多導(dǎo)致非特異結(jié)合，嘗試使用更少的抗體。
6.裂解液中蛋白含量太高，導(dǎo)致洗滌液有很多假陽(yáng)性蛋白，減少樣本用量。
7.蛋白和抗體非特異結(jié)合，可以在免疫沉淀之前預(yù)先將磁珠和樣本孵育，清理樣本中可以和磁珠結(jié)合的成分，一些研究人員也使用同型對(duì)照來(lái)預(yù)清理裂解液。
8.樣本中目的蛋白降解，樣本裂解時(shí)嚴(yán)格低溫操作，加入過(guò)量蛋白酶抑制劑。
9.高強(qiáng)度洗脫緩沖液（如SDS-PAGE上樣緩沖液）將導(dǎo)致多種非特異蛋白和抗原一起洗脫，溫和的緩沖液（如0.1M甘氨酸，pH2.5）可防止此類(lèi)污染。
二、大量抗體被洗脫
抗體用量太高，嘗試減少抗體用量。
三、沒(méi)有檢測(cè)到目的蛋白洗脫
1.樣本中目的蛋白不表達(dá)或低水平表達(dá)，如果表達(dá)水平低，需要增加裂解液用量，但也可能導(dǎo)致非特異結(jié)合的增加，所以在免疫沉淀之前需要預(yù)先清除裂解液。
2.抗體用量不夠，檢查抗體用量，提高使用量。
3.目標(biāo)蛋白沒(méi)有從磁珠上洗脫，需要確保使用的洗脫緩沖液正確。
4.抗體沒(méi)有結(jié)合磁珠，確保使用的磁珠和抗體亞型匹配，磁珠正確保存，防止變質(zhì)或干燥。
5.裂解液中鹽堿度太高，需要改用低鹽堿度裂解液。一般可選NP-40,RIPA, western及IP細(xì)胞裂解液。
四、加樣順序?qū)Π械鞍椎寐实挠绊?/strong>
磁珠、抗體、抗原樣本混合一起孵育，速度最快，但靶蛋白純度和得率會(huì)很低。
間接法是抗體和抗原樣本先結(jié)合，再加入磁珠孵育，靶蛋白得率最高，直接法是磁珠先和抗體結(jié)合，再加入抗原孵育，對(duì)于表達(dá)豐度高的蛋白，兩種方法差別不大，如果表達(dá)豐度低，要選擇間接法獲得更高的靶蛋白得率。
五、抗原洗脫方法的選擇
2.酸性洗脫法：如果要對(duì)洗脫后蛋白進(jìn)行功能分析，則用酸性洗脫法，0.1M-0.15甘氨酸（pH2.5-3）是最高效的非變性洗脫液。
3.競(jìng)爭(zhēng)洗脫法：如果靶蛋白帶有標(biāo)簽，可用高濃度標(biāo)簽或配體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性洗脫，洗脫后樣本具有生物活性，且沒(méi)有抗原片段污染。
陰性對(duì)照：如用同型對(duì)照作為陰性對(duì)照，來(lái)排除非特異結(jié)合的情況。
七、二抗如何選擇
| IP捕獲抗體 | WB檢測(cè)一抗 | WB檢測(cè)二抗 | 備注 |
| 小鼠來(lái)源 | 小鼠來(lái)源 | HRP-protein A 或HRP-抗小鼠IgG | WB一抗若為mouse lgG1/lgG3亞型，HRP-標(biāo)記 ProteinA親和力較低，可適當(dāng)降低其稀釋度（也可先嘗試HRP-抗小鼠lgG二抗); WB一抗若為小鼠 lgM/lgA亞型，則避免選擇HRP- ProteinA，因其不結(jié)合。 |
| 兔來(lái)源 | HRP-抗兔IgG | ||
| 兔來(lái)源 | 小鼠來(lái)源 | HRP-抗小鼠IgG | |
| 兔來(lái)源 | HRP-protein A或HRP-抗兔IgG輕鏈特異性抗體 | HRP-Protein A可以有效降低重鏈信號(hào)以及消減輕鏈信號(hào)的影響，背景干凈，適用于檢測(cè)目的蛋白大小除45-55kDa之外的所有目的蛋白，而目的蛋白大小在45-55kDa之間時(shí)，推薦使用HRP-標(biāo)記抗兔lgG輕鏈特異性二抗。 |
