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保存重組蛋白的原則及方法
來源：菲恩生物 發(fā)布時間：2024-01-30 16:36 點擊量：
分子生物學(xué)實驗室的同仁們都曾經(jīng)或多或少地與蛋白質(zhì)純化打過交道。在完成蛋白質(zhì)純化后，我們都面臨著如何有效保存的問題。是否遇到過同批次的蛋白，復(fù)融后，活性卻呈現(xiàn)出一些差異甚至失活？蛋白質(zhì)作為生物大分子，在純化后如果保存不當(dāng)，容易發(fā)生失活和變性的情況。因此，接下來我們將深入探討重組蛋白的妥善保存問題。
長期保存（6個月或更長）
短期保存（1周內(nèi)）：
保存蛋白質(zhì)應(yīng)該遵循下面這幾個基本原則:
1. 低溫
保存蛋白質(zhì)時，確保在低溫條件下至關(guān)重要。低溫意味著較低的能量水平，有助于減緩蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的熱運動，減少鍵的斷裂可能性。此外，在低溫下，微生物繁殖減緩，潛在的蛋白酶活性降低，從而有助于維持蛋白質(zhì)的活性。
2. 無菌
在進行蛋白質(zhì)實驗操作時，務(wù)必佩戴手套。盡管實驗室戴手套通常是為了保護實驗者自身，但在生化實驗中，蛋白質(zhì)是我們需要保護的主體。我們皮膚上存在一些蛋白酶，可能會降解蛋白樣品。此外，皮膚上的其他化學(xué)物質(zhì)也可能污染蛋白樣品。為了防止細(xì)菌生長，最好將蛋白質(zhì)保存在經(jīng)過滅菌處理的容器中。
3. 濃度
為了提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，建議以較高濃度保存重組蛋白質(zhì)，最好保持在1mg/ml以上。高濃度有助于防止蛋白質(zhì)分子附著在塑料或玻璃管壁上。不容忽視的是，疏水性蛋白質(zhì)容易附著在管壁上。
4. 分裝
蛋白質(zhì)需要冷凍保存，但在實驗中常在室溫或更高溫度使用。反復(fù)凍融過程中產(chǎn)生的冰晶會損害蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象。為減少凍融次數(shù)，建議將純化后的蛋白質(zhì)進行分裝保存，每次使用前融化所需量，以確保蛋白質(zhì)樣品經(jīng)歷單次凍融。
5. 速凍／速融
在蛋白質(zhì)溶冷凍時，為了減少蛋白質(zhì)分子在高鹽度或pH條件下的曝露時間，可選擇速凍方法。速凍可通過液氮實現(xiàn)。速凍后，蛋白質(zhì)可以存放在-20°C或-80°C中，同樣，蛋白質(zhì)的快速融化也是至關(guān)重要的，可在溫水中進行。
6. 避免震蕩
震蕩產(chǎn)生的剪切力可能對蛋白質(zhì)造成破壞。在震蕩時，液體中會生成氣泡，導(dǎo)致氧氣進入，使蛋白質(zhì)處于氧化環(huán)境中。由于蛋白質(zhì)中的半胱氨酸容易被氧化為胱氨酸，這一過程可能破壞蛋白質(zhì)的活性。
7. 添加劑
為了確保蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，需要將其保存在適當(dāng)?shù)木彌_液中，并添加一些保護劑。例如，在-20°C保存時，可添加10%-50%的甘油防止結(jié)冰，避免凍融過程。此外，還可添加防腐劑抑制細(xì)菌生長，或蛋白酶抑制劑（PMSF）以防止蛋白酶對蛋白質(zhì)的破壞。同時，添加一些還原劑如DTT可防止蛋白質(zhì)氧化。在選擇添加劑時，務(wù)必確保其不會影響蛋白的活性。
蛋白質(zhì)的保存方法取決于其穩(wěn)定性以及再次使用的時間。
對于凍干狀態(tài)的重組蛋白，由于處于完全脫水的狀態(tài)，在不受潮的情況下可以在冰箱中保存數(shù)年。
對于復(fù)融后的重組蛋白，比較合適的保存方式是分裝后保存在 -20°C 或 -80°C，六個月內(nèi)一般是沒有問題的。
（1）分裝有助于最大程度減少反復(fù)凍融對抗體和重組蛋白活性的損害，并減少從同一管中多次吸取可能導(dǎo)致的污染。
（2）分裝的量最好按一次實驗用完為準(zhǔn)，每份至少不能少于10 µl。體積越小，蛋白濃度受蒸發(fā)和管壁吸附影響的可能性越大。
（3）復(fù)融后的分裝重組蛋白如果一次用不完，將剩余母液保存在 4℃，避免再凍起來。
（4）蛋白工作液應(yīng)當(dāng)在當(dāng)天配制并當(dāng)天使用，最好不要在4℃超過1天。
對于短期保存，大多數(shù)蛋白質(zhì)可以在4°C下保存，以避免反復(fù)凍融對活性的影響。然而，4°C保存面臨微生物污染的問題。因此，如果保存時間超過24小時，建議使用0.22微米的濾膜過濾樣品，然后在無菌管中保存。值得注意的是，并非所有蛋白質(zhì)都適合在4°C下保存。
