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尊敬的用戶：

您好！衷心感謝您選擇了本公司的ELISA試劑盒！因不同公司的試劑盒、不同方法的試劑盒操作細節(jié)不盡相同，為了幫您更加高效地完成實驗，節(jié)約您的珍貴樣品及寶貴時間，請在實驗開始前認真閱讀以下幾條提示。

一、認真閱讀隨貨說明書，了解試劑盒操作步驟。試劑盒的出廠檢測步驟及數(shù)據(jù)均以隨貨說明書為依據(jù)。

二、樣品的準備：樣品準備相關材料，請查看以下連接或二維碼：https://www.fn-test.cn/downloads/
 

三、了解檢測樣品的大致含量，預估各組別所需稀釋比。因本公司可得樣品種類及數(shù)量有限，隨貨說明書建議的稀釋比為有限樣品的測試結果，以正常血清、正常血漿、細胞裂解液或細胞培養(yǎng)上清為主，不代表此指標所有樣品表達情況。因疾病或模型處理等因素，您的各實驗組樣品最佳稀釋比與說明書推薦稀釋比，可能并不相符，甚至相差十倍、百倍、甚至千萬倍。為避免試劑盒及樣品的浪費，建議您查閱相關文獻，了解目的物在相應疾病或模型處理下的變化趨勢。然后再通過一次預實驗，獲得對照組及實驗組的最佳稀釋比。

四、預實驗的必要性

預實驗看起來是浪費時間、浪費樣品、浪費試劑，但了解預實驗的目的和效果會發(fā)現(xiàn)，其實是最大的節(jié)約。首先，對這個陌生的試劑盒有了初步的了解，也是一次檢驗，避免因為操作步驟或者試劑盒本身質量問題浪費您大批量的珍貴樣品。其次，通過預實驗組別間少量樣品的檢測，可以推斷出各組樣品的最佳稀釋比。

五、預實驗的樣品稀釋方案

1、首先，板孔數(shù)目計算。預包被酶標板為12條*8孔可拆卸板條。預實驗時，需同時測試一條標準曲線及不同組別的少量樣品。若板孔預算實在緊張，至少也需測試標準品最高孔、中濃度、低濃度、零孔。不同組別間的樣品，分別選1-2個，進行不同稀釋比測試，假如每個樣品做四個不同稀釋比。所需板孔數(shù)目為標準品孔+樣品數(shù)*4。

2、預實驗樣品如何稀釋更好？是1/2,1/4,1/8,1/16這樣梯度嗎？稀釋到什么時候合適呢？

這里，建議您間隔10倍進行，參考推薦稀釋比范圍設置3-4個10倍稀釋條件。下面我們以h.CRP（C-reactive protein，C-反應蛋白）舉例：假如您有4個組別的血清樣品，說明書推薦的正常血清稀釋比是1/5000-1/10000，您通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，C-反應蛋白是在機體受到感染或組織損傷時血漿中一些急劇上升的蛋白質。所以您的樣品組，稀釋比至少需要1/10000。這時，我們來間隔10倍設計稀釋比，也就是1/10,000、1/100,000、1/1000,000、1/10,000,000。若其它指標盒子正常血清是1/2的指標，得病上升，則建議1/2、1/10、1/100、1/1000。

3、為什么要間隔10倍稀釋呢？

標準曲線一般是梯度稀釋的7個點+零孔，像一把跨度64倍的計量尺。樣品的上升或下降幅度未知，稀釋跨度過小，會浪費過多的板孔或者實驗結束發(fā)現(xiàn)仍舊超出標準曲線最高孔。稀釋跨度過大，有可能找不到最佳稀釋比。而 10倍間隔稀釋，總會有一個稀釋比剛好落在64倍計量尺之間。

六、預實驗注意事項

① 檢查試劑盒的組件。核查說明書清單中的組件是否齊全，有無缺少或者漏液的情況。若有異常，請第一時間聯(lián)系我們給您處理。

② 微量試劑會因運輸沾滿試劑管蓋，為避免損失影響實驗，請離心后再開蓋。

③ 盡量不在同一時間打開多種不同的試劑盒，以防搞混試劑盒組件。若無法避免，可使用記號筆在組件蓋子上做好標記，防止操作中混淆組件導致實驗失敗。

④ 試劑盒未開封時，置于2-8℃保存。開啟后，酶標板和凍干的標準品，可在-20℃保存來延長使用壽命。干燥的環(huán)境更利于它們的保存，一旦受潮，酶標板和標準品會喪失部分活性。其他液體試劑，置于2-8℃保存，嚴禁凍存，凍存會使性能嚴重下降。

⑤ 試劑盒所提供的凍干標準品在溶解后的最高濃度，保存于2-8℃，可在12小時內(nèi)使用，請勿凍存。合理安排時間時，您可以在12小時內(nèi)完成兩輪測試。含有2支標準品的情況下，可以進行至少4次實驗。

七、樣品稀釋小技巧

如果您檢測的物質需要稀釋比例較大，比如稀釋10萬倍，同時樣品數(shù)目過多，那么樣品稀釋的工作將是一項挑戰(zhàn)。這里我們提供一些技巧幫助您提高效率和精度。

① 準備工作：

96孔 2ml深孔板（可以滅菌，反復使用）

96孔細胞培養(yǎng)板或者酶標板（一次性使用）

加樣槽（一次性使用或者可滅菌）

10-100ul 8道或12道移液器

20-200ul或30-300 ul 8道或12道移液器

② 操作步驟：

選擇深孔板

第一步：稀釋500倍。按照深孔板的順序排列好待測樣品。使用單道移液器吸取3ul樣品加入空白深孔板的孔底，每孔加入1.497ml生理鹽水，用搖床緩慢震蕩3分鐘來混勻樣品，此時樣品為1/500稀釋，標記 S-5百倍

第二步：再稀釋100倍。繼續(xù)按第一步的方法，使用排槍吸取10ul第一步稀釋后的樣品，加入到另外一塊新的深孔板后，再向孔內(nèi)加入990ul生理鹽水，震蕩3分鐘混勻，此時樣品共稀釋了5萬倍，標記S-5萬倍。 

第三步：最后用樣品稀釋液稀釋一倍。使用50ul多道移液器向ELISA預包被酶標板樣品孔中加入50ul試劑盒自帶的樣品稀釋液，然后吸取50ul稀釋了5萬倍的（S-5萬倍）樣品加入ELISA樣品孔，震蕩3分鐘混勻樣品，此時樣品完成十萬倍稀釋。將酶標板覆膜，置于37℃溫箱靜置孵育。

③ 注意事項

一百萬倍稀釋或其他稀釋情況，請參考步驟二完成。

如果您使用96孔酶標板或細胞培養(yǎng)板來進行多樣品大比例稀釋，因板孔的最大容量為350ul/孔，可以先使用生理鹽水100倍稀釋（將3ul樣品稀釋到300ul），模仿以上方法進行稀釋。加樣前，需使用試劑盒樣品稀釋液再進行1/2稀釋來完成樣品稀釋工作（因樣品稀釋液在加樣量的最小占比是50%時，才能有效穩(wěn)定PH值，才能保證樣品檢測結果的準確性。）