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發(fā)現(xiàn)外泌體鑒定的重要性

來(lái)源:菲恩生物   發(fā)布時(shí)間:2023-09-26 16:36   點(diǎn)擊量:

外泌體最早于1983年發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞上清液中,1996年成為免疫學(xué)家的興趣點(diǎn)。外泌體是目前為止定義最為明確的細(xì)胞外囊泡, 在細(xì)胞通訊和組織微環(huán)境調(diào)節(jié)中的重要作用。
 
外泌體由很多細(xì)胞釋放,如B細(xì)胞,樹突細(xì)胞,T細(xì)胞,表皮細(xì)胞,血小板等。存在于各種體液如羊水,腹水,鼻灌洗液,唾液,血清,血漿,乳汁,尿液,腦脊髓液,以及從細(xì)胞培養(yǎng)基等。細(xì)胞生成外泌體的生理目的推測(cè)是外泌體可能從細(xì)胞中清除過(guò)量和/或不必要的成分,以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。
 
 
外泌體富含膽固醇和鞘磷脂,具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu),幾乎所有的外泌體都有微管蛋白、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白、四跨膜蛋白。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體組成存在差異,例如腸上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體含有多種代謝酶及腸組織特異性A33抗原,B細(xì)胞來(lái)源的外泌體富含CD86和MHC分子,T細(xì)胞來(lái)源的外泌體表面有促凋亡的FasL受體。以下為典型外泌體的結(jié)構(gòu)和內(nèi)容物。
 
 
外泌體與免疫反應(yīng)、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病和癌癥進(jìn)展有關(guān)。外泌體遞送到受體細(xì)胞的蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和核酸有效地改變了它們的生物學(xué)反應(yīng)。這種外泌體介導(dǎo)的反應(yīng)可能是疾病促進(jìn)或抑制。外泌體在調(diào)節(jié)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)通路中的內(nèi)在特性推進(jìn)了其在許多疾病的治療控制中的潛在效用,包括神經(jīng)退行性疾病和癌癥。
 
外泌體被提取后一般懸浮于磷酸鹽緩沖液。目前, 最常用的儲(chǔ)存方法為冷凍保存, 但是冷凍保存可能會(huì)導(dǎo)致外泌體形狀與物理性質(zhì)的改變, 也可能導(dǎo)致多層囊泡的形成和聚集, 反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致外泌體表面分子的生物特性、含量和標(biāo)志物組成發(fā)生變化。對(duì)于功能性研究,根據(jù)研究設(shè)計(jì)建議對(duì)新鮮分離的外泌體進(jìn)行立刻分析或在4 ℃或-20℃下短期保存后使用。但是對(duì)于長(zhǎng)期保存用于治療應(yīng)用的外泌體,-80℃存儲(chǔ)條件將是更可取的。
 
外泌體分離之后,需要經(jīng)過(guò)一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。鑒定方法從物理特征到表面分子標(biāo)志物,多角度進(jìn)行鑒定。主要方法包括:
透射電鏡鑒定法:簡(jiǎn)稱TEM,適合外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)觀察,即通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形。
納米顆粒跟蹤分析法:簡(jiǎn)稱NTA,該方法能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測(cè)速度快,檢測(cè)后能提供外泌體粒徑和濃度信息。
Western blot分子標(biāo)志物檢測(cè):外泌體標(biāo)志蛋白包括四跨膜蛋白家族,如CD9、CD63和CD81;細(xì)胞質(zhì)蛋白,如肌動(dòng)蛋白(Actin)和鈣磷脂結(jié)合蛋白(Annexins);參與生物功能的分子,如凋亡轉(zhuǎn)接基因2互作蛋白X(ALIX)、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)、熱休克蛋白(HSP70、HSP90),以及細(xì)胞分泌的特異性蛋白。
親脂染料標(biāo)記外泌體:目前已發(fā)表的外泌體文章中,外泌體大多使用親脂性染料進(jìn)行標(biāo)記,體內(nèi)和體外都有較多應(yīng)用。親脂性染料主要分為兩大類,第一類是PKH67(綠色熒光)/PKH26(紅色熒光),由于它們可以與外泌體的脂質(zhì)雙層膜穩(wěn)定結(jié)合,所以染色效果較好,應(yīng)用較廣泛。
 
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