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實(shí)驗(yàn)中Sirt1靶點(diǎn)3大檢測(cè)詳解
來(lái)源：菲恩生物 發(fā)布時(shí)間：2021-02-02 17:11 點(diǎn)擊量：
Sirt1是什么？
Sirt1是一個(gè)全長(zhǎng)747aa的NAD依賴的脫乙?；? 屬于sirtuin家族。翻譯后修飾的SIRT1是一個(gè)110-130kda的蛋白質(zhì)，包含一個(gè)脫乙酰酶sirtuin型結(jié)構(gòu)域。TNF-alpha處理可誘發(fā)C末端缺失的75-80kda的SirT1片段, 另外SirT1存在一個(gè)57-61kda的亞型。SIRT1可能存在于核仁、核常染色質(zhì)、異染色質(zhì)和內(nèi)膜中。它能在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭。SIRT1通過(guò)催化關(guān)鍵蛋白的去乙酰化來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和肌肉分化等過(guò)程,在氧化應(yīng)激和DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。
一、Sirt1的WB檢測(cè)
在 Western Blot 實(shí)驗(yàn)中，樣本準(zhǔn)備是實(shí)驗(yàn)成功的第一步。
1.裂解樣本時(shí)加入足量的蛋白酶抑制劑防止蛋白降解。
2.該蛋白高度修飾，分子量達(dá)到130kd，可在轉(zhuǎn)膜液中加入終濃度 0.1% 的 SDS 以提高轉(zhuǎn)膜效率。
3.使用 Bradford，Lowry 或 BCA 法對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。每個(gè)泳道加入 20-50μg 總蛋白，確保sirt1含量在 WB 檢測(cè)限之上。
背景過(guò)高是 Western Blot 中常常出現(xiàn)的問(wèn)題。對(duì)于此類問(wèn)題，建議優(yōu)化抗體濃度以獲得最佳的信噪比，使用菲恩生物FNab07877 anti- SIRT1 antibody進(jìn)行WB檢測(cè)結(jié)果如下:
二、Sirt1的IHC檢測(cè)
組織塊從生物體上取下后由于酶的作用會(huì)迅速降解。所以需要通過(guò)化學(xué)試劑的作用使蛋白交聯(lián)（多聚甲醛，福爾馬林等），防止組織自溶，維持抗原性并防止抗原彌散。但是過(guò)度固定會(huì)封閉抗原表位，導(dǎo)致信號(hào)減弱甚至消失。另外，一抗的濃度對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常重要。濃度過(guò)低得不到陽(yáng)性信號(hào)，濃度過(guò)高可能產(chǎn)生非特異性結(jié)合，造成假陽(yáng)性。
Sirt1定位于細(xì)胞核，為獲得理想的染色結(jié)果，建議：
1.根據(jù)組織塊大小和類型確定固定時(shí)間，一般在4% 多聚甲醛（PFA）固定 18-24 小時(shí)。
2.推薦使用 pH 6 的枸櫞酸鈉，熱修復(fù) 20-30 分鐘或使用胰蛋白酶、蛋白酶 K 進(jìn)行酶修復(fù)。
3.若切片厚度大于 5μm，推薦使用 0.2% Triton X-100 PBS 對(duì)切片進(jìn)行通透處理 10 分鐘。使用菲恩生物FNab07877 anti- SIRT1 antibody進(jìn)行IHC檢測(cè)結(jié)果如下:
三、Sirt1的IF檢測(cè)
相比于與組織切片，培養(yǎng)的細(xì)胞需要固定的時(shí)間更短，同時(shí)醛基的自發(fā)熒光對(duì)于熒光檢測(cè)常常帶來(lái)干擾。
為了獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推薦：
1.使用 4% PFA 固定細(xì)胞 20 分鐘，過(guò)度固定會(huì)使信號(hào)減弱。
2.使用 0.3M 甘氨酸淬滅醛基引起的自發(fā)熒光。
3.檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)抗原Sirt1時(shí)，使用 0.1% Triton X-100 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行 5 分鐘的通透處理。使用菲恩生物FNab07877 anti- SIRT1 antibody進(jìn)行IF檢測(cè)結(jié)果如下:
菲恩生物SIRT1相關(guān)產(chǎn)品
抗SIRT1抗體 （貨號(hào) FNab07877）
人SIRT1(sirtuin1) ELISA試劑盒 （貨號(hào) EH3785）
