服務(wù)熱線
15623758226
Annexin V細(xì)胞凋亡實驗原理及應(yīng)用
來源：菲恩生物 發(fā)布時間：2024-05-11 14:52 點擊量：
細(xì)胞凋亡，也被稱為程序性細(xì)胞死亡，是一種有序的、由基因控制的細(xì)胞死亡方式。它是生物體正常發(fā)育和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵機制之一。
細(xì)胞凋亡過程常伴隨明顯的形態(tài)學(xué)變化，比如在凋亡早期，細(xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸（PS）的外翻。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，它對于磷脂酰絲氨酸（PS）有極強的結(jié)合力。在細(xì)胞凋亡早期，原本只分布在正常細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）會翻向外側(cè)，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。此時，用標(biāo)記了熒光素（如FITC）的Annexin V作為熒光探針，可以特異地與外翻的PS結(jié)合，從而標(biāo)記出凋亡早期的細(xì)胞。PI（Propidium iodide）是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可以透過凋亡晚期或者壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核結(jié)合呈現(xiàn)紅色。
了解完Annexin V細(xì)胞凋亡實驗原理后，下面我們一起看一下具體的實驗流程。
1.獲得好的實驗結(jié)果，需要做好實驗前的準(zhǔn)備工作，首先得設(shè)置好實驗方案，具體如下（按照Annexin V-FITC/PI試劑盒用流式細(xì)胞儀器檢測為例）。
| 組別 | 實驗?zāi)康?/td> |
| 空白對照（Blank） | 調(diào)節(jié)閾值和儀器電壓 |
| Annexin V-FITC單陽組 | 調(diào)節(jié)補償，輔助調(diào)節(jié)電壓 |
| PI單陽組 | |
| 生物學(xué)對照（Negative） | 排除實驗操作對實驗結(jié)果的影響，劃門依據(jù) |
| 實驗組（Test） | 實驗結(jié)果 |
2.消化貼壁細(xì)胞
對于貼壁細(xì)胞，先用適量胰酶(不含EDTA)消化細(xì)胞，而懸浮細(xì)胞可省去此操作。
需要注意以下幾點：
1）由于EDTA是Ca2+螯合劑，EDTA會絡(luò)合Ca2+，從而影響Annexin V與PS的結(jié)合，若使用含EDTA的胰酶有可能會造成假陰性，所以建議用不含EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞。
2）如需使用含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，有必要在染色之前用PBS或結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞多次以去除EDTA，從而避免螯合Annexin V所必需的Ca2+。
3）消化細(xì)胞的時間不能太久，處理細(xì)胞時要輕柔，若過度消化或機械損傷細(xì)胞都會導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，從而造成假陽性。
4）培養(yǎng)基中也存在已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，因此也收集下來進(jìn)行檢測。
5）檢測前細(xì)胞密度為80%-90%即可，細(xì)胞過密會導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，增加了凋亡細(xì)胞的比例
3.重懸細(xì)胞
無論是懸浮細(xì)胞還是貼壁細(xì)胞(消化后)進(jìn)行細(xì)胞重懸，輕柔吹打洗滌，并離收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，進(jìn)行計數(shù)。
4.取細(xì)胞懸液(細(xì)胞總數(shù)為1-5×10 ?cells)加入熒光標(biāo)記的Annexin V和碘化丙啶 (PI)輕輕混勻，室溫避光孵育15min。
5.染色孵育后，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測或熒光顯微鏡檢測。流式細(xì)胞儀檢測時，以Annexin V-FITC為例，可使用FITC通道(通常是FL1)檢測Annexin V-FITC。PE通道(通常是FL2)檢測PI。用流式軟件進(jìn)行分析，以FITC為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)，繪制雙色散點圖。
流式結(jié)果圖：
凋亡實驗中主要分析細(xì)胞凋亡早期，流式凋亡結(jié)果圖各個象限結(jié)果代表如下：
左上象限(Annexin V-/PI+)：左上象限為裸核細(xì)胞；Annexin V-/PI+象限中細(xì)胞數(shù)越多，實驗結(jié)果可信度就越低，因盡量控制本象限細(xì)胞比例。
左下象限(Annexin V-/PI-)：左下象限為正常的活細(xì)胞；
右上象限(Annexin V+/PI+)：右上象限為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞，細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光；
右下象限(Annexin V+/PI-)：右下象限為早期凋亡細(xì)胞，在細(xì)胞凋亡的早期PI無法著染，不會產(chǎn)生紅色熒光信號。
1、對照組比處理組凋亡比例高：
a.細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)不理想；
b.收集細(xì)胞后，沒有及時染色；
c.過分吹打、震蕩，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，PS暴露出來。
2、處理組比對照組凋亡比例低：
a.對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)刺激強度不足；
b.過度增殖的細(xì)胞對凋亡誘導(dǎo)不敏感；
c.貼壁細(xì)胞消化時間過長，導(dǎo)致膜表面的PS受損，Annexin V結(jié)合位點減少。
菲恩生物細(xì)胞凋亡試劑盒相關(guān)產(chǎn)品如下：
上一篇：【文獻(xiàn)解析】硼可提高圍產(chǎn)期動物的鈣吸收能力 | 下一篇：沒有了
