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自噬（autophagy）是由 Ashford 和 Porter 在 1962 年發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)有“自己吃自己”的現(xiàn)象后提出的，是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細胞內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體（autophagosome），并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。

自噬的功能

1.饑餓應答時的作用,在不同的器官如肝臟或在培養(yǎng)細胞中,氨基酸的匱乏會誘導細胞產(chǎn)生自體吞噬,由自體吞噬分解大分子,產(chǎn)生在分解代謝和合成代謝過程中所必須的中間代謝物。

2.在細胞正?；顒又械淖饔?如在動物的變態(tài)發(fā)育、老化和分化過程中,自體吞噬負責降解正常的蛋白以重新組建細胞。盡管通常人們認為自體吞噬不具有選擇性,但是在某些病理和壓力條件下,通過自體吞噬能選擇性地隔離某些細胞器,如線粒體、過氧化物酶體等。

3.在某些組織中的特定功能,如黑質(zhì)的塞梅林神經(jīng)節(jié)中,多巴胺能神經(jīng)元中的神經(jīng)黑色素的合成就需要把細胞質(zhì)中的多巴胺醌用自噬囊泡包被隔離起來。

自噬過程的LC3

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (LC3， MAP1LC3)，是Atg8在哺乳動物中的同源物。LC3/Atg8 被具有蛋白內(nèi)切酶活性的Atg4在羧基端剪切，生成胞漿型 LC3-I。在自噬形成時，胞漿型LC3-I通過Atg7 和 Atg3（分別對應泛素激活酶E1和泛素結(jié)合酶E2）參與的類泛素樣反應，使磷脂酰乙醇胺 (PE) 偶聯(lián)，生成脂質(zhì)化形式的 LC3，也稱作 LC3-II，它附著到自噬體(autophagosome)的膜上，是自噬體的結(jié)構(gòu)蛋白，即自噬體膜型LC3-II。在降解過程中，位于自噬溶酶體外膜的LC3-II被半胱氨酸蛋白酶Atg4B切割，產(chǎn)生LC3-I循環(huán)利用；位于內(nèi)膜的LC3-II則與包裹的內(nèi)容物一起，被溶酶體降解。導致自噬溶酶體中LC3含量很低。

在哺乳動物中，存在 4 種LC3異構(gòu)體（LC3A、LC3B、 LC3B2和 LC3C），在不同的組織細胞中表達會有差異。目前主要研究的是LC3A和LC3B，LC3C在許多細胞中表達量很低，研究的也較少。其中每種異構(gòu)體都可以有I和II兩種亞型。

在進行自噬研究時，檢測 LC3-I 和 LC3-II 幾乎是必做的實驗，利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成。自噬形成時，胞漿型LC3會酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟PE結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II），因此LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。那么，進行 LC3 檢測時，需要注意哪些要點呢？

1.需要知道樣本的LC3表達量和表達的種類。不表達或者表達量很低樣本，就不適合用于自噬的研究。使用LC3A或LC3B的抗體均可，使用LC3A/B抗體，同時檢測兩種，可以大大提高實驗成功率。

2.LC3-I 和 II 存在一個生成-降解的動態(tài)過程，所以單時間點 LC3-II 的表達改變并不能體現(xiàn)自噬的改變，需要使用一些阻斷溶酶體降解的藥物（如氯喹、巴佛洛霉素 A1 等），判斷在干預手段下，細胞的自噬程度的改變。氯喹可以通過抑制溶酶體功能（比如升高它的 pH 值），抑制 LC3-II 的降解；巴佛洛霉素 A1 則是一種強效 V-ATPase 抑制劑，阻斷溶酶體依賴的降解。在「堵漏」的前提下，根據(jù)一段時間內(nèi) LC3-II 的積聚程度，判斷自噬的改變。

3.目前的 LC3 抗體所檢測的抗原表位都位于 LC3 的 N 端，由于 PE 基團結(jié)合可能導致 N 端區(qū)域的構(gòu)象變化，使得抗體對 LC3-II 的親和性更高，所以 LC3-II 條帶顯色深并不能代表該樣本處于高自噬狀態(tài)。另外，LC3-I 對反復凍融更為敏感，也更易在 SDS 上樣緩沖液中降解?；谝陨蟽蓚€原因，在半定量時，除了使用 LC3-II/LC3-I 的比值外，也有科學家使用 LC3-II 與管家蛋白（Housekeeping Protein）的比值進行半定量。

4.LC3是膜相關(guān)蛋白，在細胞裂解后，對其進行冰上短暫超聲，促進蛋白的溶解，將 LC3 從膜上解離。LC3-I 和 LC3-II 是小分子蛋白，雖然理論上LC3II分子量更大，由于帶負電的PE改變了LC3II的性質(zhì)，使其疏水性更強，導致其在電泳中遷移率更高。所以，LC3II電泳后停留在更小分子量（約14kDa）。

5.由于LC3-I 與 LC3-II 分子量小，又僅有 2 KD 差異，WB注意選用高濃度分離膠（約15%），轉(zhuǎn)膜使用0.22μm轉(zhuǎn)印膜，濕轉(zhuǎn)70V，1.5h或半干轉(zhuǎn)2.5A，7min。