服務(wù)熱線(xiàn)
15623758226
磷酸化抗體使用注意事項(xiàng)
來(lái)源：菲恩生物 發(fā)布時(shí)間：2023-08-18 14:30 點(diǎn)擊量：
蛋白質(zhì)磷酸化是一種重要的細(xì)胞信號(hào)傳遞機(jī)制，它通過(guò)將磷酸基團(tuán)添加到蛋白質(zhì)分子上，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。
蛋白激酶：將磷酸基團(tuán)加到蛋白特定氨基酸上，使蛋白磷酸化
蛋白磷酸酶：負(fù)責(zé)磷酸化蛋白的去磷酸化
磷酸化主要是針對(duì)磷酸化位點(diǎn)制備的，可以特異性識(shí)別磷酸化氨基酸位點(diǎn)，檢測(cè)蛋白磷酸化水平，對(duì)磷酸化蛋白進(jìn)行定性、定量分析。磷酸化抗體可以用來(lái)檢測(cè)該蛋白在細(xì)胞受到刺激時(shí)的磷酸化水平的變化情況，側(cè)重于了解該蛋白的一種活性狀態(tài)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中約30%的蛋白質(zhì)在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)被磷酸化，不適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)磷酸化是許多人類(lèi)疾病的原因。
一個(gè)蛋白可以有多個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，那么有哪些氨基酸容易發(fā)生磷酸化呢？下圖展示了磷酸化類(lèi)型以及常見(jiàn)磷酸化位點(diǎn)：
| 蛋白質(zhì)磷酸化類(lèi)型 | 蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn) |
| O-磷酸化 | 絲氨酸（Serine；Ser；S） |
| 蘇氨酸（Threonine；Thr；T） | |
| 酪氨酸(Tyrosine；Tyr；Y） | |
| N-磷酸化 | 組氨酸(Histidine; His; H) |
| 精氨酸（Arginine；Arg；R） | |
| 賴(lài)氨酸（Lysine; Lys: K) | |
| S-磷酸化 | 天冬氨酸(Aspartic acid；Asp；D) |
| 谷氨酸(Glutamic acid；Glu；E) | |
| ?；姿峄?/span> | 半胱氨酸(Cysteine；Cys；C) |
O-磷酸化類(lèi)型最常見(jiàn)，在酸性條件非常穩(wěn)定，因此在細(xì)胞生物學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中研究廣泛。N-磷酸化不穩(wěn)定導(dǎo)致其檢測(cè)具有挑戰(zhàn)性。S-磷酸化和?；姿峄难芯繄?bào)道很少。
那么如何確定一個(gè)蛋白存在哪些磷酸化位點(diǎn)呢？下面以u(píng)niprot 網(wǎng)站為例給大家介紹下查找方法：
1.通過(guò)https://www.uniprot.org/鏈接進(jìn)入uniprot 官網(wǎng)，主界面如下：
2.以人源TAU蛋白為例，在search欄輸入TAU,進(jìn)入如下界面，找到human TAU：
3.點(diǎn)擊P10636進(jìn)入后，點(diǎn)擊左側(cè)PTM/Processing查看蛋白修飾情況以及修飾的氨基酸位點(diǎn)：
磷酸化蛋白WB檢測(cè)樣本制備有哪些注意事項(xiàng)呢？
1.快、狠、準(zhǔn)。蛋白磷酸化是一個(gè)快反應(yīng)，制樣過(guò)程要迅速，樣品要新鮮，全程冰上操作。所有用到的試劑，器具要提前預(yù)冷。制備的樣本需要盡快變性并放在-80°保存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致磷酸基團(tuán)降解。
2.裂解液中一定要加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，否則條帶出來(lái)會(huì)很淺。細(xì)胞裂解會(huì)釋放大量?jī)?nèi)源性蛋白磷酸酶，會(huì)催化磷酸化蛋白去磷酸化。還要注意檢測(cè)蛋白磷酸化位點(diǎn)是什么氨基酸，如果是酪氨酸位點(diǎn)磷酸化還要加1μmol/L的原釩酸鈉。
磷酸化蛋白WB檢測(cè)內(nèi)參如何選擇？
磷酸化蛋白檢測(cè)需要設(shè)置2個(gè)內(nèi)參，一個(gè)是普通內(nèi)參比如actin或GAPDH, 保證上樣量一致；另一個(gè)是磷酸化蛋白對(duì)應(yīng)的總蛋白，比如檢測(cè)AKT磷酸化，同時(shí)還要跑一個(gè)AKT總蛋白的抗體，只有磷酸化蛋白與總蛋白比值變化了才能說(shuō)明書(shū)磷酸化水平發(fā)生改變了。
WB實(shí)驗(yàn)需要提高上樣量嗎?
磷酸化蛋白表達(dá)豐度低，大概只有總蛋白10%甚至更低，所以每孔需要足夠蛋白量，必要時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行特定刺激提高磷酸化蛋白表達(dá)水平。如下圖展示，F(xiàn)Nab10910 anti- Phospho-p53 (Ser15) antibody ，UV刺激后細(xì)胞的磷酸化蛋白表達(dá)水平升高。
磷酸化蛋白檢測(cè)用什么封閉液以及一抗孵育條件？
轉(zhuǎn)膜后，建議用5%BSA封閉1小時(shí)，非實(shí)驗(yàn)級(jí)別奶粉可能含有磷酸酶等雜質(zhì)，不適用于磷酸化蛋白檢測(cè)。封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致抗原標(biāo)為掩蓋。
一抗孵育建議4℃過(guò)夜，不僅讓抗體有充足時(shí)間結(jié)合，低溫環(huán)境使蛋白不容易從膜上脫落。
