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菲恩生物SABC試劑盒
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產(chǎn)品詳情
| 名稱： | Fine Test SABC KIT | ||||||||||||||||
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| 貨號： | IHC0004 | ||||||||||||||||
| 工作液的準(zhǔn)備： | √ 菲恩生物SABC系統(tǒng)中可以使用許多不同的緩沖液。最常見的一種是10 mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.4，0.9％的磷酸鹽緩沖液。SABC工作液方案的準(zhǔn)備如下： √ 封閉液：將2ml封閉血清加入10mlPBS中。優(yōu)選的用于封閉的血清是從制備生物素化的第二抗體的相同物種制備的。 √ 生物素化抗體工作溶液：將100ul生物素化抗體添加到10 ml封閉血清工作溶液中（含有封閉血清的PBS）。 √ SABC試劑工作溶液：在EP管中快速混合100ul試劑A和100??ul試劑B。然后在37°C下放置30分鐘，將混合物加入10 ml封閉血清工作溶液（含有封閉血清的PBS）中使用。最好在12小時(shí)內(nèi)使用SABC試劑工作溶液。 √ 配置表
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| 免疫組化染色介紹： | √ 鏈霉親和素的分子量為60,000，對小分子量的生物素具有極高的親和力。由于對于大多數(shù)抗原而言，這種親和力比抗體的親和力高出一百萬倍，因此鏈霉親和素與生物素的結(jié)合(不同于抗體-抗原的相互作用)基本上是不可逆的。因?yàn)殒溍褂H和素有四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，可以有效利用生物素/鏈霉親和素系統(tǒng)，而且大多數(shù)蛋白質(zhì)(包括抗體和酶)都可以與幾個(gè)生物素分子結(jié)合。這些方面為鏈霉親和素和生物素化酶之間形成大分子復(fù)合物提供了可能。
√ 基于這些特性，我們設(shè)計(jì)了一種免疫過氧化物酶程序，用于定位多種組織學(xué)上有意義的抗原和其他標(biāo)記。(Hsu SM, Raine L, Fanger H: Am. J. Clin. Pathol. 7 5, 734-738, 1981; Hsu SM, Raine L, Fanger H: J . Histochem. Cytochem. 2 9, 577-580, 1981.)該技術(shù)使用未標(biāo)記的一抗、生物素化的二抗和已經(jīng)形成的親和素和生物素化辣根過氧化物酶大分子復(fù)合物。 √ Fine test的SABC試劑盒包含鏈霉親和素和生物素化的辣根過氧化物酶試劑，這些試劑被特別制備成用于免疫酶染色的理想復(fù)合物。雖然鏈霉親和素和生物素化的辣根過氧化物酶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)尚不清楚，但證據(jù)表明它由許多生物素化的辣根過氧化物酶分子由鏈霉親和素交聯(lián)成三維陣列。該復(fù)合物顯然很少有暴露的生物素殘留物，但保留至少一個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。該復(fù)合物的形成是通過將鏈霉親和素和生物素化的辣根過氧化物酶在稀溶液中按特定比例混合而實(shí)現(xiàn)的。最初孵育后，復(fù)合物幾乎沒有變化，僅通過免疫酶染色敏感性的少量增加就可以判斷，復(fù)合物在形成后幾小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。Fine test SABC系統(tǒng)的高靈敏度和較短的孵育時(shí)間可能是由于與復(fù)合物相關(guān)的活性辣根過氧化物酶分子的數(shù)量以及復(fù)合物與生物素化抗體的快速，不可逆的相互作用。使用Fine test SABC試劑盒可獲得的低背景染色可能是由于該方法中使用的一級抗血清和其他試劑的稀釋度高，親和純化的生物素化二抗的質(zhì)量以及經(jīng)特殊制備的鏈霉親和素和生物素化的辣根過氧化物酶復(fù)合物。 | ||||||||||||||||
| 提供試劑(100次試驗(yàn))： |
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| 石蠟切片的染色步驟： | 1.通過二甲苯或其他清潔劑和分級酒精系列對組織切片進(jìn)行脫蠟和水化處理。
2.在自來水中沖洗5分鐘。 3.如果需要淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性，則將切片在0.3％H2O2的甲醇或水中孵育30分鐘。通過使用更高濃度的H2O2可以縮短孵育時(shí)間。如果內(nèi)源性過氧化物酶活性沒有問題，則可以刪除步驟3。 4.在緩沖液中洗滌5分鐘。 5.用稀釋的封閉液孵育切片60分鐘，該溶液來自產(chǎn)生二抗的物種。（在非特異性染色不是問題的情況下，可以刪除步驟5和6）。 6.從各部分上吸取多余的阻斷血清工作溶液。 7.用緩沖液稀釋中的一抗血清將切片孵育60分鐘。（如果發(fā)生背景染色，則可以在含有1-2％適當(dāng)封閉血清的緩沖液中稀釋一抗和二抗。） 8.在緩沖液中將載玻片洗滌5分鐘。 9.用稀釋的生物素化二抗溶液孵育切片60分鐘。 10.在緩沖液中將載玻片洗滌5分鐘。 11.用Fine生物 SABC試劑工作溶液孵育切片30分鐘 12.在緩沖液中將載玻片洗滌5分鐘。 13.在過氧化物酶底物溶液中孵育切片，直到形成所需的染色強(qiáng)度。（見注意事項(xiàng)1）用自來水沖洗切片。 14.復(fù)染，清洗并封片。 | ||||||||||||||||
| 注意事項(xiàng)： | 1.含疊氮化鈉或其他過氧化物酶活性抑制劑的溶液不得用于稀釋過氧化物酶底物或SABC試劑。不要在SABC試劑中添加正常血清，脫脂奶粉，培養(yǎng)基或其他生物素潛在來源。這可能會(huì)導(dǎo)致靈敏度降低。
2.顯影時(shí)間可能會(huì)因抗原水平，所需染色劑的強(qiáng)度或所用底物而異。DAB一般應(yīng)顯色2-10分鐘；AEC 10-30分鐘；TMB 5-20分鐘。由于反應(yīng)產(chǎn)物的溶解性或缺乏色彩對比，某些復(fù)染可能與某些過氧化物酶底物不兼容。可根據(jù)要求提供復(fù)染色兼容性表。 3.如果要稀釋的試劑超過建議的濃度，請首先按照說明中的說明制備稀釋的生物素化抗體和SABC試劑。隨后的稀釋液應(yīng)在含有0.1％免疫組織化學(xué)級牛血清白蛋白的緩沖液中稀釋。僅應(yīng)使用免疫組化等級BSA，因?yàn)槠渌苿┛赡芎胁恍枰碾s質(zhì)。稀釋這些試劑可能需要更長的孵育時(shí)間和/或更高的孵育溫度，以實(shí)現(xiàn)最大的靈敏度。 4.該部分應(yīng)做好準(zhǔn)備。固定（通常在甲醛含量不超過4％的福爾馬林緩沖液中）應(yīng)在整個(gè)染色過程中保持切片的完整性，但又不至于破壞所研究的抗原。在染色過程中，請勿使切片變干。使用加濕箱進(jìn)行孵育。 5.為避免抗體吸附到進(jìn)行最終稀釋的塑料或玻璃容器中，可以將第一抗體稀釋在含有0.1％免疫組化級牛血清白蛋白或稀釋的封閉血清的緩沖液中。 6.孵育時(shí)間可能會(huì)縮短。如果切片中的抗原濃度高，建議與一抗，生物素化二抗和SABC試劑的孵育時(shí)間會(huì)減少。據(jù)報(bào)道，在某些情況下，將孵育溫度提高到37°C時(shí)，只需5分鐘的孵育時(shí)間就足夠了。如果抗原濃度低，則可以延長步驟7和9以實(shí)現(xiàn)最大程度的染色。 |
